广东省房安白蚁防治服务中心 官网-广州白蚁防治所-广州白蚁防治中心-广州白蚁防治公司
全国服务热线:400-8166-786
24小时技术专线:13798178238
服务热线电话:020-36138705
防治知识
白蚁防治 杀虫
专注白蚁灭治,白蚁预防、杀虫灭鼠、四害消杀等城市卫生害虫防治服务 广州白蚁防治所 广州市白蚁防治所 广州白蚁防治 广州白蚁公司 广州白蚁防治公司
客户服务热线
020-36138705 400-8166-786
预约热线
13798178238
服务邮箱
QQ在线客服
上班时间 08:00-22:00,节假日不休息

您所在的位置:首页    防治知识
防治知识
分子生物学技术在白蚁种类鉴定中的应用研究 房安
发布日期:2017-3-18 17:56:11     作者:    已有  阅读过本文

.前言
    白蚁是一种世界性重要害虫。全世界已知白蚁种类有约3000种[1],我国约400多种[2],在长江以南地区危害尤为严重。它们与人类经济密切相关,可对人类社会造成较大危害[3-4]。早期传统的形态分类法为白蚁的分类鉴定奠定了基础。白蚁的外部形态相似,目前白蚁主要依靠兵蚁或有翅成虫进行分类[5]。但是在区分一些相似种、近缘种上难度较大,容易引起误判[6-7]。同时,白蚁的形态学分类往往需要一定数量的个体,分类时个体太少则会影响结果的可靠性,而有些白蚁种群的兵蚁很少,这都给白蚁的分类带来了较大的困难。
    基于聚合酶链式反应( Polymerase chainreaction, PCR)技术为物种鉴定提供了新的手段,弥补了传统形态鉴定的诸多不足[8]。该技术通过引物和模板DNA特异性的结合, 可在短时间内扩增出数百万特异DNA序列拷贝。它具有如下几个优点:(1)不受白蚁组织类别、发育阶段等影响。DNA上得到的信息不会随白蚁发育时期的不同而变化。(2)不受环境影响。因为环境只影响基因表达,而不改变基因的核苷酸序列。(3)DNA分子标记技术简单、快速、易于自动化。(4)提取的DNA样品,在低温下可长期保存[9]。因此,近年来分子生物学技术被越来越广泛地应用于白蚁分类研究中。线粒体编码细胞色素c氧化酶亚基Ⅱ基因(COⅡ)已成为当前动物分子系统中应用最广泛的分子标记[10]。Jenkins等首次利用COⅡ基因序列推断台湾乳白蚁入侵危害的途径[11]。Miura等利用线粒体COⅡ基因和翻译的蛋白质序列对进化较高的白蚁科和鼻白蚁科15个属的系统发育关系进行了研究[12]。
    本研究在广东省范围内采集白蚁标本,并采用基于COⅡ基因部分序列的PCR产物直接测序法鉴别确认白蚁种类,该研究可为今后开展白蚁种群分布和危害调查提供科学基础,从而进一步掌握蚁害发生特点,提高白蚁防治水平。
2.材料和方法
2.1材料和仪器
2.1.1材料和试剂
    一次性组织研磨棒、1.5mL离心管、200μL PCR薄壁管,1000μL、200μL、10μL枪头、上下游引物均购;Takara r-taq 酶(250U)、Takara DL 2000 DNA marker(500μL)购;EasyPure Genomic DNA提取试剂盒、Axygen胶回收试剂盒、Biowest Agarose琼脂糖(100g)。
2.1.2仪器设备
    梯度PCR仪、琼脂糖水平电泳仪、手提紫外分析仪、Fresco 21微型离心机、凝胶成像系统、电子分析天平(0.0001g)、全自动蒸汽高压灭菌锅、移液枪、超级恒温水浴锅。
2.2试验方法
2.2.1白蚁样本采集
    从全广东省范围内,特别是白蚁危害重点区域采集白蚁标本。采集白蚁时,取活体或死亡时间少于24 h的完整成虫体,密封保存于99.9%酒精的样本瓶中,做好标签和记录。
2.2.2白蚁组织基因组DNA提取
    选取白蚁整体为试验材料,用纸巾将样品表面的酒精和水分吸干后,称重,控制样品质量≤25 mg。样品用研磨棒研磨,采用EasyPure Genomic DNA提取试剂盒提取样品基因组DNA。最后用EB溶液进行两次洗脱,合并两次的洗脱液用于PCR反应的模板。
2.2.3 PCR扩增COⅡ基因部分序列
2.2.3.1引物
    通常用于种群分类分析的基因是16S rRNA、COI、COII、ND1、ND5[2]。本文采用以下引物用于片段扩增:上游引物COⅡ1:5’-CAGATAAGTGCATTGGATTT-3’;下游引物COⅡ2:5’-GTTTAAGAGACCAGTACTTG-3’。
2.2.3.2扩增体系
    采用Takara公司生产的PCR试剂盒。反应体系50μL,包括:5μL10×buffer(Mg2+-),4μLdNTP,3μLMg2+,正反引物各1μL(20 mmol/L),1μLDNA模板,17μL灭菌超纯水。
PCR反应条件如下:起始94℃预变性3min,然后94℃变性30s,50℃退火1 min,72℃延伸1 min,30个循环。最后72℃反应10 min。PCR产物用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,并用EB染色。用DNA marker(DL2000)标记扩增片段大小,以确定是否为目的片段。电泳后置于凝胶成像系统观察。
对于有杂质,需要纯化的PCR产物,采用Axygen胶回收试剂盒纯化后测序;对于扩增效果良好的PCR产物则可直接测序。本实验广东生物资源应用研究所进行测序和拼接,每个样品采用正反链双向测序,以提高测序的准确度。
2.2.4数据分析
    根据委托公司发回的测序结果,将正反链拼接得出的碱基序列在NCBI网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上进行BLAST相似性搜索,选择相似度最高的确定为该物种。
3.结果与分析
3.1白蚁标本采集结果
    在广东省范围内,特别是白蚁危害重点区域共收集有效白蚁标本185个。
3.2 PCR扩增结果
    以编号zj144、zj035、zj115、zj102、zj101、zj100、zj099、zj097、zj095、zj094、 zj093、zj092的样品为例,PCR扩增结果见图1。引物对检测样本扩增出800bp左右的条带。结果显示,检测样本的PCR扩增结果与设计目标相同;同时,目标条带明亮清晰,说明PCR扩增特异性较高,效果良好,PCR产物可直接测序。
图1引物PCR扩增图(从左到右条带分别为DNA marker(DL2000)、zj144、zj035、zj115、 zj102、zj101、 zj100、 zj099、zj097、zj095、zj094、 zj093、 zj092)
3.3 测序结果
    以编号zj004的白蚁标本为例,测序后拼接得出的碱基序列如图2所示。将碱基序列在NCBI网站上进行BLAST相似性搜索,结果见图3。结果显示,zj004号样本与台湾乳白蚁这一物种的基因相似度最高,相似度达99%。同时结合形态学特征,确认zj004号样本为台湾乳白蚁。
图2 zj004号白蚁样本拼接碱基序列
4.总结与展望
    本研究在广东省范围内采集白蚁标本185份,经分子生物学方法共鉴定出2科4属7种白蚁。散白蚁所占比例明显高于其他属白蚁,其中黑胸散白蚁比例最高,为该地区优势蚁种。
    随着分子生物学的发展,利用分子生物学技术进行种类鉴别、检测的应用越来越多[13-14]。本文利用分子生物学技术对白蚁种类做出鉴别,无论白蚁何种生物型和虫态,均可用于鉴定;同时需要的样品量少,简便快捷,提取的DNA模板可用于多次检测。但需要注意的是,要防止昆虫标本DNA降解,才能获得可靠准确的遗传信息。相信随着研究的不断深入,实验技术将不断完善和提高。在结合形态学鉴定的基础上,现代分子生物技术正成为白蚁分类鉴定的有力手段,为进一步开展白蚁的分布和危害调查提供更为坚实的科学基础,并为白蚁防治提供新的方法和思路。

                                              广东房安白蚁防治

                                              2017年3月18日

返回
上一篇  没有了!
下一篇  广东房安开展白蚁施工现场拍照存档 提升白蚁防治工作
关于我们
业务范围
新闻资讯
成功案例
施工播报
防治知识
联系我们
广东房安白蚁防治有限公司
电话:020-36138705 400-8166-786    13798178238
地址:广州市白云区同和街握山中路41号
穗白蚁行协资质证字第:44010131
穗白蚁行协会员证字第: 44010181
广东房安白蚁防治.All Rights Reserved">  粤ICP备15061333号